Granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus erdvinės struktūros elementų nustatymas peptidinio žemėlapio metodu
Granuliocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (GCSF) yra biofarmacinis vaistas turintis daug analogų. GlikoPEGiliavimo technologija yra sukurtas GCSF analogas konjuguotas su 20 kDa PEG polimeru. Baltyminiams biofarmaciniams vaistams, kuriems yra priskiriamas GCSF ir jo analogai, yra svarbu kontroliuoti pakitimus baltymo amino rūgščių sekoje ir struktūroje. Šio darbo tikslas yra identifikuoti ir įvertinti GCSF struktūrinių elementų pokyčius ribotos proteolizės peptidinio žemėlapio metodu glikoPEGiliuoto GCSF, dePEGiliuoto GCSF ir oksiduoto GCSF baltymo analoguose, taikant optimizuotą struktūrinių pokyčių įvertinimo sistemą.Atlikta 15 sėkmingų bandymų, kurių metu baltymo ir jo analogo struktūros buvo veikiamos denatūruojančių ir oksiduojančių sąlygų. Taip pat atlikta baltymo ir PEG konjugato jungties degradacija. Rezultatai nustatyti ribotos proteolizės peptidinio žemėlapio metodika, taikant RP - HPLC - UV - Vis ir RP - HPLC - MS metodikas.Tyrimo metu nustatyta, kad GlikoPEGiliuoto GCSF karpymo pobūdis, ribotos proteolizės peptidinio žemėlapio sąlygomis, atitinka natyvaus GCSF karpymo profilį ir santykinį peptidų susidarymo greitį, tai patvirtina, kad analizuojami struktūriniai elementai šiose molekulėse yra identiški.Bandymų rezultatai apibendrinti ir optimizuoti, pateikiant struktūrinių pokyčių įvertinimo principus, kuriuos sieja ribotos proteolizės peptidinio žemėlapio, mokslinės literatūros ir kompiuterinio modeliavimo metodai.Darbą sudaro 6 dalys: įvadas, literatūros analizė, medžiagos ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas. Darbo apimtis - 100 p. teksto be priedų, 39 iliustr., 14 lent., 136 bibliografiniai šaltiniai.
Granulocyte colony stimulating factor (GCSF), has many biopharmaceutical analogs. One of the is PEG-SA-GCSF - a GlycoPEGylated GCSF protein conjugated with 20 kDa PEG polymer. The key tool to perform quality control for biopharmaceutical proteins is detection of changes in structure and sequence. The Master's work covers identification and evaluation of GCSF protein structure by limited proteolysis peptide mapping. In order to create optimized evaluation system glycoPEGylated, oxidized and denatured protein analogs were used. 15 experiments were performed using denaturatated, oxidized, glycoPEGylated and dePEGylated samples. Results were determined by limited proteolysis peptide mapping coupled with RP - HPLC - UV - Vis and RP - HPLC - MS methods.The study found that the nature of glycopegylated GCSF cleavage under limited proteolysis peptide mapping conditions is consistent with the native GCSF cleavage profile and the relative rate of peptide formation, confirming that the analyzed structural elements in these molecules are identical.Ther resuts were evaluated and optimized providing the guidelines based on limited proteolysis peptide mapping, scientific literature and in silico computation. Structure: introduction, literature review, materials and methods, results and considerations, conclusions, references. Thesis consist of: 100 p. text without appendixes, 39 pictures, 14 tables, 136 bibliographical entries.