Rekombinantinio insulino geno klonavimas į E.coli BL21(DE3) kamieną bei atrinkto klono biosintezės proceso pritaikymas didelėje gamybos skalėje
Tauraitė, Daiva | Recenzentas / Rewiewer |
Bironaitė, Daiva | Darbo gynimo komisijos pirmininkas / Thesis Defence Board Chairman |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member |
Baigiamojame magistro darbe aprašytas insulino geno įklonavimas į pET28(+) vektorių ir perkėlimas į raiškos kamieną E.coli BL21(DE3). Darbo metu atrinktas klonas ir patvirtintas genetinio konstrukto tapatumas DNR sekoskaita. Paruoštas tiriamasis ląstelių bankas insulinas/pET28b(+)/E.coli BL21(DE3). Insulino gamybai tirtos optimalios fermentacijos sąlygos: indukcijos laikas, gliukozės pamaitinimo limitacijos, IPTG koncentracijos ir temperatūros pakeitimas po indukcijos. Optimizuotas procesas buvo perkeltas į didelės skalės gamybą. Analitinėje darbo dalyje tiriamas paruošto ląstelių banko plazmidės stabilumas, švarumas ir gyvų ląstelių skaičius. Biosintezės metu analizuojamas ląstelių optinis tankis, šlapios biomasės išeiga, Lowry metodu tiriama bendų baltymų išeiga, tikslinio baltymo išeiga tiriama SDS PAGE metodu. Gauti rezultatai leidžia daryti išvadą, kad pasiektos optimaliausios biosintezės sąlygos kuomet indukcijos laikas 70±5 o.v., gliukozės limitacija 85/75 %, IPTG koncentracija 0,25mM ir temperatūra mažinama iki 25 °C po indukcijos.Darbą sudaro 7 dalys: įvadas, literatūrinė dalis, metodinė dalis, tyrimo rezultatai bei jų aptarimas, išvados, darbe naudoto literatūros sąrašas.Darbo apimtis - 77 puslapiai, 30 paveikslų, 10 lentelių ir 72 bibliografiniai šaltiniai.
This Master Thesis described insulin gene cloning into the pET28(+) vector and transferring to E.coli BL21(DE3) for expression. A clone was selected and the genetic construct was confirmed by DNA sequencing. The insulin/pET28b(+)/E.coli BL21(DE3) research cell bank was prepared. Optimal fermentation conditions for insulin production, including induction time, glucose feeding limitations, IPTG concentration, and post-induction temperature change, were investigated. The optimized process was transferred to large-scale production. The analytical part of the study examined the stability, purity, and number of living cells in the prepared cell bank plasmid. During biosynthesis, the optical density of the cells, the yield of wet biomass, the yield of total proteins, and the yield of the target protein were analyzed by the Lowry and SDS PAGE methods. Results indicated that the most optimal biosynthesis conditions were reached with an induction time of 70±5 o.u., glucose limitation of 85/75%, IPTG concentration of 0.25mM, and a post-induction temperature of 25 °C. Thesis structure: introduction, literature review, methodology, research results and discussion, conclusions, and a list of references. Thesis consist of: 77 pages, 30 figures, 10 tables, and 72 bibliographic sources.