Krienų peroksidazės imobilizavimas ir taikymas vandenilio peroksidą generuojančių sistemų tyrimui
Baigiamajame magistro darbe nagrinėjamas vandenilio peroksido koncentracijos nustatymo aktualumas ir tikslai. Išnagrinėti pagrindiniai principai, kuriais remiantis nustatomos vandenilio peroksido koncentracijos įvairiose jį generuojančiuose sistemose. Darbo tikslui pasiekti naudojamas fermentas peroksidazė, selektyviai redukuojantis vandenilio peroksidą iki vandens. Fermento aktyvumui pasireikšti reikalingos redukuojančios medžiagos, keičiančios spalvą priklausomai nuo redukcijos laipsnio. Ištirta peroksidazės reakcijos kinetika, naudojant įvairias redoks aktyvias medžiagas: (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono) rūgštis (ABTS), o- dianizidinas, pirogalolas, 4-aminoantipirinas (AAP)). Sukurta vandenilio peroksido nustatymo metodika su ant aktyvuoto silikagelio imobilizuota peroksidaze. Nešiklis eksperimentiškai pasirinktas iš eilės kitų nešiklių (aktyvuotos anglies, hidratuoto aliuminio oksido, polistireno), lyginant įvairiais būdais imobilizuoto fermento kinetines ir fizikochemines savybes. Ištyrus paaiškejo, kad ant aktyvuoto silikagelio kovalentiškai imobilizuota peroksidazė pasižymi didesniu fermentiniu aktyvumu ir temperatūriniu stabilumu, taip pat platesniu pH veikimo diapazonu. Sausos imobilizuoto fermento granulės gali būti naudojamos iki 4 mėnesių, gyvavimo puslaikis 113 dienų. Metodas, kuriame naudojama ant aktyvuoto silikagelio imobilizuota peroksidazė, leidžia vizualiai testuoti vandenilio peroksido koncentraciją įvairiose terpėse pagal sudarytą žalios spalvos paletę nuo 2 iki 60 μM ribose. Referentiniu metodu išmatuotas gliukozės, laktato, glicerofosfato oksidazių fermentinis aktyvumas gerai koreliuoja su spektrofotometriniu metodu, kuriame naudojama imobilizuota peroksidazė. Ant aktyvuoto silikagelio imobilizuota peroksidazė pritaikyta vandenilio peroksido ir gliukozės oksidazės aktyvumo nustatymui įvairiuose medaus mėginiuose. Ištirti 14 skirtingų Lietuvos regionų surinkti medaus mėginiai, kuriuose oksidazės koncentracija svyruoja nuo 0,03 iki 1,49 U/g medaus.
The aim of this research project was to examine importance and relevance of hydrogen peroxide concentration determination. General principles of methods for the concentration of hydrogen peroxide determination in different generating systems were analysed. In order to achieve purpose of a project, enzyme peroxidase which selectively reduces hydrogen peroxide to water was chosen. Reducing substances that changes color depending on the degree of reduction were used for determination of enzyme activity. Kinetics of peroxidase reaction were determined with different redox substances (ABTS, o-dianisidine, pyrogallol, AAP). Hydrogen peroxide determination method based on peroxidase's immobilization on activated silica gel was created. Silica gel carrier was experimentally selected from a number of other carriers (activated carbon, hydrated alumina, polysthyrene). Immobilized enzyme kinetic and physico-chemical properties were compared. Peroxidase immobilized on activated silica gel had higher enzyme activity, better temperature stability and was operated in a wider range of pH values. Dry pellets of immobilized peroxidase can be used up to 4 months. This method allows to determine the concentration of hydrogen peroxide in various medium by using the green color pallete in the data range of 2 to 60 μM. Reference method which allows to determine activity of glucose, lactate, glycerophosphate oxidases well correlated with the spectrophotometric method in which immobilized peroxidase was used. Peroxidase immobilized on silica gel was applied for hydrogen peroxide and glucose oxidase activity measurement in various honey samples. Honey samples collected from 14 different Lithuanian regions contained glucose oxidase which concentration is generally in the range of 0.03 to 1.49 U/g. Structure: introduction, review of literature, materials, devices ant methods, results and discussion, conclusions and references.Thesis consists of: 61 p. text without appendixes, 27 pictures, 10 tables, 86