Modifikuoto hepatocitų augimo faktoriaus ekspresijos sistemos kūrimas ir panaudojimas 3D ląstelių kultūrose
Kundrotaitė, Eglė Aušrinė |
Bernotienė, Eiva | Recenzentas / Rewiewer |
Bironaitė, Daiva | Darbo gynimo komisijos pirmininkas / Thesis Defence Board Chairman |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member |
Baigiamajame magistro darbe nagrinėjamos hepatocitų augimo faktoriaus modifikavimo ir naujų sukurtų konstruktų veikimo bei panaudojimo galimybės. Augimo faktoriai geba stimuliuoti įvairius ląstelių procesus - migraciją, diferenciaciją, proliferaciją. Tačiau pristačius tokius augimo faktorius norimą audinį, dėl intersticinių skysčių srovių, jie būtų per trumpą laiką pašalinti iš audinio. Todėl reikalingos technologijos, kurios leistų imobilizuoti norimame audinyje reikalingus augimo faktorius ar baltymines molekules ir išlaikyti kuo ilgiau jų biologinį aktyvumą. Regeneracijos galimybės su sintetiniais genais, kurie gali būti įmobilizuojami į dirbtinę mikroaplinką leidžia imituoti naturialią mikroaplinką ir skatinti regeneraciją, žaizdų gijimą, ląstelių atsinaujinimą. Šiame darbe pateikta išsami HGF modifikavimo eiga, pridėjus TG seką, kurią sudaro NQEQVSP peptidas, dėl jos baltymas gali kovalentiškai prisijungti prie fibrino hidrogelių. Šis peptidas yra Faktoriaus XIII substratas ir visi baltymai, kurie turi tokį peptidą gali būti kovalentiškai prijungiami prie fibrino hidrogelių ir likti funkciškai aktyvūs. Šiame darbe buvo sukonstruota universali modifikuotų baltymų ekspresijos plazmidė, leidžianti ekspresuoti žinduolinėse ląstelėse rekombinantinius baltymus. Sukurtos HGF baltymą koduojančios tarpinės plazmidės iš kurių HGF baltymas perkeltas į universalias modifikuotas baltymų ekspresijos plazmides. Pasiekta raiška E.Coli sistemoje. Pateikta, kad ląstelės pagamina ir sekretuoja rekombinantinius TG-HGF ir HGF-TG baltymus. Šiame darbe buvo pateikta, kad sukurtuose 3D ląstelių migracijos modeliuose su ląstelių sferoidais sekretuojami modifikuoti HGF-TG ir TG-HGF baltymai funkciškai aktyvūs ir stimuliuoja ląstelių migraciją. Darbą sudaro 4 dalys: įvadas, lietratūros apžvalga, metodinė dalis, rezultatai, išvados, literatūros sąrašas.Darbo apimtis 60 p. teksto be priedų, 35 iliustr., 20 lent., 50 bibliografiniai šaltiniai.
This Master's thesis explores the possibilities of modifying hepatocyte growth factor and the performance and applications of the new constructs. Growth factors are capable of stimulating various cellular processes such as migration, differentiation and proliferation. However, when such growth factors are delivered to the desired tissue, interstitial fluid currents would result in their removal from the tissue within a short time. Therefore, technologies are needed to immobilise the required growth factors or protein molecules in the desired tissue and maintain their biological activity for as long as possible. Regeneration options with synthetic genes that can be immobilised in an artificial microenvironment allow to mimic the natural microenvironment and promote regeneration, wound healing and cell renewal. In this work, a detailed modification of HGF is presented by the addition of a TG sequence consisting of the NQEQVSP peptide, which allows the protein to covalently bind to fibrin hydrogels. This peptide is a substrate of Factor XIII and all proteins that contain this peptide can covalently bind to fibrin hydrogels and remain functionally active.In this work, a versatile modified protein expression plasmid was constructed to express recombinant proteins in mammalian cells. Intermediate plasmids encoding the HGF protein were constructed from which the HGF protein was transferred to the universal modified protein expression plasmids. Expression in E.Coli was achieved. The production and secretion of recombinant TG-HGF and HGF-TG proteins by the cells is demonstrated. In this work it was reported that in 3D cell migration models developed with cell spheroids, secreted modified HGF-TG and TG-HGF proteins are functionally active and stimulate cell migration.