Daugkartinio imunojutiklio kūrimas interleukinui 10 nustatyti biologinėse terpėse
Pašukonienė, Vita | Recenzentas / Rewiewer |
Interleukinas 10 (IL-10) yra priešuždegiminis citokinas, kuris reguliuoja imuninį atsaką į patogenus bei palaiko normalią audinių homeostazę. Šiame baigiamajame darbe buvo siekiama sukurti imunojutiklį interleukinui 10 biologinėse terpėse nustatyti, kuris pasižymėtų grįžtamu orientuotų antikūnų imobilizavimu, jautria analize, daugkartiniu bei paprastu naudojimu. Tyrimo metu paruošta imunoanalizės platforma, kurios pagrindą sudaro skirtingomis baltymus prijungiančiomis savybėmis pasižymintis savitvarkis monosluoksnis (STM) iš alkantiolių, suformuotas ant auksu dengto lusto. Antikūnai ant lusto paviršiaus buvo kryptingai imobilizuoti per baltymo G (SpG) sąveiką. Grįžtamam antikūnų imobilizavimui naudotas chelatinis junginys - HS-(CH2)11EG3-tris-NTA (EG3-trisNTA). Medžiagų bei paviršiaus sąveikos vertintos vaizdinančiu elipsometriniu paviršiaus plazmonų rezonanso metodu.Eksperimentų metu baltymų nejungiančios zonos, kurių elipsometrinis storis gautas ̴̴ 2 nm, formuotos mikrokontaktinio antspaudavimo būdu iš HS-(CH2)11EG3-OMe (EG3-OMe) alkantiolio tirpalo. Atlikti tyrimai su 98 % žmogaus serumu parodė, jog ant šio paviršiaus vyko nespecifinė baltymų adsorbcija, tačiau ją galima sumažinti į terpę pridėjus detergento „Tween 20”. Funkcines zonas formuojant iš 30 µM HS-(CH2)11EG3OH (EG3-OH) ir EG3-trisNTA mišinio, kuriame yra dalinė 10 % (mol) EG3-trisNTA koncentracija, His6-Tag turinčių baltymų imobilizavimas yra efektyviausias. Esant dalinei 10 % (mol) EG3-trisNTA koncentracijai, EG3-trisNTA paviršinis padengimas siekia ̴ 57,38 %.Sukurta imunoanalizės platforma pasižymėjo imunoanalizinių zonų atsikartojamumu bei specifiškumu tiksliniam baltymui nustatyti. Tačiau įvertinta, jog tik ̴ 15% imobilizuotų antikūnų dalyvauja sąveikoje su tiksliniu baltymu.
Interleukin 10 (IL-10) is an anti-inflammatory cytokine that regulates the immune response to pathogens and maintains normal tissue homeostasis. The aim of this final work was to develop an immunosensor for the detection of interleukin 10 in biological media, which would be characterized by reversible immobilization of targeted antibodies, sensitive analysis, multiple and simple use.During the study, an immunoassay platform was prepared, which is based on a self-assembled monolayer (SAM) of alkanethiols with different protein-binding properties formed on a gold-coated chip. Antibodies on the chip surface were targeted immobilized through protein G (SpG) interaction. A chelating compound HS-(CH2)11EG3-tris-NTA (EG3-trisNTA) was used for reversible immobilization of antibodies. Material-surface interactions were evaluated by imaging ellipsometric surface plasmon resonance method.Non-protein-binding zones with an ellipsometric thickness of ̴ 2 nm were formed by microcontact printing from HS-(CH2)11EG3-OMe (EG3-OMe) alkanethiol solution. Studies with 98 % human serum have shown non-specific protein adsorption on this surface, but this can be reduced by adding detergent Tween 20 to the medium. Meanwhile, immobilization of His6-Tag-containing proteins is most efficient by forming functional zones from a mixture of 30 µM HS-(CH2)11EG3OH (EG3-OH) ir EG3-trisNTA with a partial concentration of 10 % (mol) EG3-trisNTA. At a partial concentration of 10 % (mol) EG3-trisNTA, the surface coverage of EG3-trisNTA is ̴ 57,38 %.The developed immunoassay platform was characterized by the repeatability and specificity of the immunoassay zones for the determination of the target protein. However, it is estimated that only ̴ 15 % of immobilized antibodies interact with the target protein.