Bisulfitu modifikuotos DNR paruošimo optimizavimas analizei mikrogardelių technologija
DNR mikrogardelės yra vienas efektyviausių genomo tyrimo metodų. Viena iš galimų šios technologijos panaudojimo sričių yra epigenetiniai tyrimai. Dažniausiai sutinkamas epigenetinis žymuo yra citozino, esančio DNR sudėtyje, metilinimas 5 bazės pozicijoje. Šios modifikacijos lygmuo ir paplitimas gali būti siejamas įvariais genomo pokyčiais ar sutrikimais, tokiais kaip vėžiniai susirgimai ar chromosomų kompaktizacija. Bisulfitine? konversija yra daz?niausias metilintu? citozinu? nustatymo metodas, tačiau turi dideli? tru?kuma? - šiuo metodu apodorojama DNR yra hidrolizuojama. Ši hidrolizė gali iškreipti DNR stuktūrą ir taip apsunkti jos analizę mikrogardelėmis. Kaip ir daugeliui kitų DNR analizės metodų, mikrogardelėmis tiriama genominė medžiaga privalo būti tinkamai apdorota ir padauginta. Šiam tikslui darbe naudojamoje mikrogardelių sistemoje yra pasitelkiama E. coli DNR polimerazės I didysis subvienetas (Klenovo fragmentas). Tai yra gana dažnai panašiuose in vitro eksperimentuose sutinkamas fermentas.Šio darbo metu buvo ištirtas Klenovo fragmento padauginimo šališkumo priklausomybė nuo padauginamos DNR GC sudėties, metilinimo lygmens ir konversijos bisulfitu. Nustatytas papildomų manipuliacijų, tokių kaip ligavimas ar fragmentacijos sąlygų keitimas, poveikis genotipavimui mikrogardelėmis ir sekoskaitai. Atliktas genotipavimas ir nustatytos optimalios sąlygos padauginti bisulfitu konvertuotą žmogaus genominę DNR analizei mikrogardelėmis.Darbą sudaro šešios dalys: įvadas, literatūros apžvalga, medžiagos ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, literatūros sąrašas. Darbo apimtis - 70 p. teksto be priedų, 33 iliustr., 33 lent., 90 bibliografinių šaltinių, 9 priedai.
DNA microarrays are one of the most efficient methods used for genome analysis. This technology could potentially be used for epigenetic studies. One of the most commonly encoured epigenetic marker is methylation of DNA cytosines at 5th position of heterocyclic group. Modification of this sort has been implicated in development of certain cancer types, chromosome compactization and other processes.Bisulfite conversion is most commonly used method in the determination of methylated cytosines but has a major drawback - following the treatment DNA is highly hydrolyzed. This vigorous hydrolysis can distort the DNA stucture and thus complicate the analysis using the microarrays. As with many other DNA analysis methods, genomic material must be properly processed and amplified. Microarray system used in this work utilizes the large subunit of E. coli DNA polymerase I, for amplifications. This enzyme is quite commonly used for similar in vitro applications.During this work, biases of Klenow fragment and their dependence on DNA GC content, methylation level, ligation of bisulfite converted DNA as well as actual amplification reaction composition were investigated. Differently manipulated and amplified material was also analyzed and characterized using genotyping microarray assays.The work consists of six parts: introduction, literature review, materials and methods, results and discussion, conclusions, references. Thesis consist of: 70 p. text without appendixes, 33 pictures, 33 tables, 90 bibliographical entries, 9 appendixes.