M-MuLV atvirkštinės transkriptazės mutantų savybių tyrimas
Mykolaitienė, Brigita |
Serva, Saulius | Recenzentas / Rewiewer |
Bironaitė, Daiva | Darbo gynimo komisijos pirmininkas / Thesis Defence Board Chairman |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member | |
Darbo gynimo komisijos narys / Thesis Defence Board Member |
Atvirkštinių transkriptazių (AT) vykdoma komplementarios DNR sintezė - vienas iš dažniausių molekulinėje biologijoje taikomų metodų. AT reakcijoje gauta komplementarioji DNR gali būti naudojama tolesniuose klonavimo, genų raiškos bei sekoskaitos procedūrose. Vienas iš tokių fermentų yra M-MuLV, kurio platus pritaikymas biotechnologijų srityje skatina jo tobulinimą ir savybių tyrimus.Evoliuciuonuojant M-MuLV baltymą įmanoma pagerinti jo aktyvumą, procesyvumą ir sumažinti jautrumą slopikliams. Darbo tikslas - ištirti atsirinktų mutantų daromą įtaką atvirkštinės transkripcijos reakcijai. Magistro baigiamajame darbe yra pateikiama M-MuLV AT taškinių mutantų konstravimo metodika, taškinių mutacijų įterptimo optimizuotos sąlygos, temperatūrinio gradientinio PGR metodu naudojant reakcijos priedus. Gavus mutantines M-MuLV AT plazmides, atliekamas tikslinio taškinio mutanto baltymo gryninimas gravitacinės chromatografijos metodu, iš kurio tiriama baltymo koncentracija, grynumas, savitasis aktyvumas, funkcionalumas ir terminis stabilumas. Pagal seniau atliktus tyrimus, bandėme sukonstruoti aštuonis taškinius mutantus, tačiau atliekant eksperimentus, du mutantus teko atmesti, dėl neteisingos indukcijos baltymo gryninimo stadijoje.Darbą sudaro 6-ios dalys: įvadas; literatūros apžvalga; medžiagos, metodai; rezultatai ir jų aptarimas; išvados; literatūros sąrašas.Darbo apimtis: 69 psl. teksto be priedų, 21 paveikslas, 31 lentelė ir 63 bibliografiniai šaltiniai
Synthesis of complementary DNA by reverse transcriptases (RT) is one of the most common methods used in molecular biology, the obtained complementary DNA can be used in further cloning, gene expression and sequencing procedures. One such enzyme is M-MuLV, whose wide application in the field of biotechnology encourages its improvement and properties research. By evolving the M-MuLV protein, it is possible to improve its activity, processivity and reduce sensitivity to inhibitors. The aim of the work is to investigate the influence of the selected mutants on the reverse transcription reaction. The Master's thesis presents the methodology for the construction of M-MuLV Rt site specific mutants, the optimized conditions for the insertion of site specific mutations, the temperature gradient PCR method and the help of reaction additives. After obtaining the mutant M-MuLV RT plasmids, the target site specific mutant protein is purified by gravity chromatography, from which the protein concentration, purity, specific activity, functionality and thermal stability are studied. According to previous studies, we tried to construct eight site specific mutants, but in the course of the experiment, two mutants had to be rejected due to incorrect induction at the protein purification stage.The work consists of 6 parts: introduction; literature review; materials, methods; results and their discussion; conclusions; bibliography.Scope of work: 69 pages. text without appendices, 21 figures, 31 tables and 63 sources