Inulinazių iš Helianthus tuberosus L. gumbų heterogeniškumo tyrimas
Blinkevičiūtė, Justina |
Topinambai - astrinių (lot. Asteraceae) šeimai priklausantys augalai, kurių rezervinis polisacharidas yra inulinas. Jį augaluose skaldo fermentai inulinazės, priklausančios hidrolazių klasei. Šiame darbe tirti inulinaziniai fermentai, esantys topinambų (lot. Helianthus tuberosus) gumbuose. Sukurta šių fermentų išskyrimo ir gryninimo schema, kurioje panaudotos trys chromatografijos rūšys: jonų mainų, hidrofobinės sąveikos ir giminingumo chromatografija. Pateiktas gryninimo balansas, kuomet pradinis augalinės žaliavos kiekis buvo 500 g gumbų. SDS-PAGE ir pH optimumo nustatymo eksperimentai parodė, jog iš viso išgrynintos trys skirtingos inulinazių izoformos. Jų molekuliniai svoriai: I izoformos 53,4 kDa, II izoformos 69,1 kDa ir III izoformos 70 kDa. Taip pat nustatyti visų trijų fermentų pH optimumai: I izoformos pH 3,5, II izoformos pH 3,0, III izoformos pH 5,0. Atlikti substratinio specifiškumo eksperimentai, kurių metu gautiems duomenims aprašyti pasirinktas daugiavietis modelis. Šiuo modeliu nustatyti parametrai (maksimalūs reakcijos greičiai ir disociacijos konstantos) parodė, jog visoms trims išgrynintoms izoformoms geriausias substratas yra inulinas, o prasčiausias sacharozė. Visais tirtais substratinio specifiškumo atvejais vykdant fermentines reakcijas (su substratais: inulinu, 1-kestoze ir sacharoze) stebimas kooperatyvumo tipas teigiamas, išskyrus III inulinazei dalyvaujant reakcijoje su sacharoze stebimas neigiamas kooperatyvumas. Darbo apimtis - 88 p. teksto be priedų, 21 paveikslas, 5 lentelės, 67 bibliografiniai šaltiniai.
The Jerusalem artichoke (lot. Helianthus tuberosus), also called sunroot or topinambour, belongs to Asteraceae plant familly. The tubers of the Jerusalem artichoke accumulate inulin type fructan. These polycarbohydrates are hydrolyzed by hydrolase family enzymes called - inulinases. These enzymes have important role in plant metabolism and degradation of fuctans. In this work, inulinases from tubers of Jerusalem artichoke was purificated. Three methods of chromatography were used for purification of these enzymes: ion exchange, hydrophobic interaction and affinity chromatography. A typical purification balance of three separate purification procedure from 500 g of tubers is presented. SDS-PAGE and pH optimum investigation results showed that there were three separate isoforms of inulinases purificated. Molecular mass of these enzymes was determined: I isoform 53,4 kDa, II isoform 69,1 kDa and III isoform 70 kDa. Also these three isoforms demonstrated different pH optimum: I isoform pH 3,5, II isoform pH 3,0, III isoform pH 5,0. Also substrate specificity experiments were performed and for analysis of results multi-site binding model was applied. Results of maximal velocity and dissociation constant showed that inulin is the best substrate for all three inulinases, and sucrose is the poorest substrate. In all cases cooperativity was positive, except when sucrose participated in reaction with III isoform. Then negative cooperativity was observed. Structure: introduction, part of theory, materials and methods, results, conclusions and references. Thesis consists of: 88 p. text, 21 pictures, 5 tables and 67 bibliographical entries.