Rekombinantinės TaqI restrikcijos endonukleazės gryninimo technologijos kūrimas
Baigiamąjame magistro darbe buvo sukurta rekombinantinės TaqI restrikcijos endonukleazės gryninimo technologija. Buvo parinktos Escherichia coli biomasės ardymo sąlygos, pritaikyta efektyvi temperatūrinio denatūravimo stadija, kurios optimalios sąlygos - kaitinimo trukmė ir temperatūra - nustatytos naudojant faktorinį eksperimentą. Toliau TaqI fermento gryninimui buvo naudotas chromatografijos metodas. Parinkti tokie chromatografiniai sorbentai (afininis - Heparin HyperD ir jonų mainų - Q Sepharose High Performance) bei sąlygos, kad išgrynintas TaqI baltymas būtų be funkcinių priemaišų. Taikant sukurtą gryninimo schemą iš 1 gramo E.coli ląstelių TaqI restrikcijos endonukleazės gauta 440 kartų daugiau, palyginanti su dabar UAB Fermente naudojama natyvios TaqI restrikcijos endonukleazės gryninimo schema. Gryninimo metu atliktų eksperimentų efektyvumas buvo vertinamas pagal savitajį TaqI fermento aktyvumą bei pašalintas funkcinines priemaišas.Darbą sudaro aštuonios dalys: įvadas, literatūros apžvalga, medžiagos ir metodai, tyrimo rezultatai, ir jų aptarimas, išvados, padėka, literatūros sąrašas ir priedai.Darbo apimtis - 66 psl., 22 paveikslai, 11 lentelių, 50 bibliografinių šaltinių.Atskirai pridedami darbo priedai.
Recombinant TaqI restriction endonuclease purification technology was developed in the master thesis. Disruption conditions of Escherichia coli biomass were developed. Effective thermal denaturation stage was applied and optimal conditions - heating time and temperature - were determined using factorial experiment. Afterwards the chromatographic method was used for the further purification of TaqI enzyme. The sorbents (affinity - Heparin HyperD and ion exchange - Q Sepharose High Performance) and the conditions were selected so that the purified protein TaqI had no functional contaminants after purification. Using the developed purification scheme 440 times more TaqI restriction endonuclease was produced from 1g of E.coli biomass in comparison with the native TaqI restriction endonuclease purification scheme currently used by UAB Fermentas.Efficiency of the purification scheme was assessed according to the specific activity of the TaqI enzyme activity and absence of functional contaminants.Thesis consist of: 66 p. text without appendixes, 22 pictures, 11 tables, 50 bibliographical entries.Appendixes included.